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    產品FAQ

    細胞培養常見問題解答

    Q:培養基 pH 值異常

    A:

    ? 二氧化碳分壓設置錯誤:根據培養基中碳酸氫鈉的濃度而增加或降低培養箱中二氧化碳分壓。

    ? 培養箱無二氧化碳:定期觀察二氧化碳壓力表,及時更換二氧化碳鋼瓶。

    ? 細胞培養瓶蓋擰得過緊:將蓋子旋松 1/4 圈,或換成透氣蓋培養瓶。

    ? 細菌、真菌污染 丟棄細胞和培養基。

    ? 培養基中的平衡鹽不匹配:二氧化碳平衡環境中使用以 Earle's 平衡鹽為基礎的培養基,大氣條件下使用以Hank's 平衡鹽為基礎的培養基。

    ? 碳酸氫鹽緩沖系統緩沖能力不足:加入 HEPES 緩沖液,使其終濃度為 10-25 mM。


    Q:細胞生長緩慢

    A:

    ? 培養基或血清改變:比較不同培養基中葡萄糖、氨基酸等成分有無差異;增加細胞接種密度;更換新鮮培養基。

    ? 必需生長促進成分 ( 如 L- 谷氨酰胺或生長因子 ) 缺乏、耗盡或降解使用新鮮培養基或向現有培養基中添加必需成分。

    ? 細胞初始接種密度過低:增大細胞接種密度。

    ? 支原體污染:檢測培養物有無支原體污染,如果被污染,則棄之,或用支原體清除試劑進行清除。

    ? 細胞代次過高:取用新的細胞。

    ? 輕度細菌或真菌污染:在添加抗生素的培養基中培養細胞,如果培養物被污染,則棄之。

    試劑儲存不當血清應置于-5℃至 -20℃下儲存 ;培養基應置于 2-8℃下避光儲存;完全培養基應置于2-8℃下避光儲存,并限在2周內使用。


    Q:細胞死亡

    A:

    ? 胰酶消化過度:縮短胰酶消化時間或降低消化用胰酶的工作濃度。

    ? 細胞狀態差:取用新的細胞。

    ? 支原體污染:檢測培養物有無支原體污染,如果被污染,則棄之,或用支原體清除試劑進行清除。

    ? 培養基中無附著因子:如采用無血清培養方法,應確保其含有附著因子,或使用包被過的培養器皿。

    ? 培養箱中無二氧化碳:定期觀察二氧化碳壓力表,及時更換二氧化碳鋼瓶。

    ? 培養箱溫度有波動:監測培養箱內溫度。

    ? 轉染試劑毒性過強,細胞代次過高,質粒純度差使用低毒性的轉染試劑或在轉染后及時換液;使用低代次細胞轉染 ;使用高品質的質粒轉染。

    ? 細胞解凍或凍存過程中損傷大:取用新的細胞。

    ? 培養基的滲透壓不正確:檢查完全培養基的滲透壓。大多數哺乳動物細胞可耐受的滲透壓為 260-350 mOsmol/kg,昆蟲細胞可耐受的滲透壓為 340-380 mOsmol/kg。

    ? 培養基中有毒代謝產物蓄積過多:更換新鮮培養基。


    Protein Marker使用常見問題解答

    Q:條帶模糊的原因?

    A:

    ? 電壓過高或電泳時間過長,產熱過多導致電泳緩沖液溫度升高。建議參照Trans產品使用說明書。

    ? 電泳緩沖液陳舊,建議使用新鮮的電泳緩沖液,為了獲得理想的結果建議在使用前預冷緩沖液。

    ? 分離膠的濃度偏低,建議使用合適的膠濃度。

    ? 凝膠放置時間過長,建議使用新配制的凝膠電泳。


    Q: 為什么有時候帶型不整齊?

    A:

    ? 建議點樣時將蛋白Marker放在泳道中間。如在凝膠兩側泳道,由于邊緣效應、離子強度不均等原因,均會導致帶型變寬或彎曲。

    ? 凝膠配制不勻,凝膠內存有氣泡,或點樣孔中有細碎的殘膠。


    Q:電泳時蛋白Marker分離不開?

    A:大多為膠濃度不合適,要在推薦的凝膠濃度范圍內使用。此外,比較陳舊的凝膠和緩沖液也會造成電泳效果不好。


    Q:預染Marker電泳后清晰,但是轉膜后顏色很淺?

    A:

    ? 轉膜時一定要將膠和膜壓緊,否則條帶會在轉膜過程中丟失或變淺。

    ? 轉膜條件不適合,建議200 mA、2小時,或100 mA過夜轉膜。


    Q:轉膜時甲醇的濃度是多少,會對轉膜造成什么影響?

    A:甲醇的濃度一般推薦為15%,甲醇濃度太高易造成蛋白穿膜,轉移到濾紙上。


    Q:發光液配制需要避光嗎?

    A:不需要避光,但是要現配現用,配制后馬上進入暗室進行下面的操作。


    Q:發光液的有效曝光時間多長?

    A:發光液在2小時以內均可以曝光,但是前30分鐘曝光能力較強,隨著時間的推移可適當延長曝光時間來調節曝光強度。


    Q:曝光后X光片背景很黑是什么原因?

    A:背景很黑可能是曝光時間太長或者顯影時間過長造成的。


    Q:Western Marker 曝光后雜帶很多是什么原因?

    A:Marker上樣量過多或曝光時間過長,可適當減少上樣量或曝光時間。此外,二抗的濃度過高或特異性和純度不高,也會造成雜帶較多的結果。


    His標簽蛋白純化常見問題解答

    Q:層析柱堵塞?

    A:待純化蛋白樣品中存在固體雜質,多見于菌體裂解液直接上樣。建議對樣品微濾 (0.45μm) 處理。


    Q:目的蛋白不與介質結合?

    A:

    ? 目的蛋白沒有 His 標簽,其原因可能是載體構建有誤、表達提前終止 (C端融合表達His 標簽)、二級翻譯起始 (N端融合表達His標簽)等等。建議測序檢查,或嘗試更換表達載體。

    ? His標簽折疊在蛋白質內部沒有暴露。該情況多見于包涵體蛋白在變性條件下的純化。建

    議充分變性蛋白,可以嘗試使用更強的變性劑 (如用6 M鹽酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶劑 (SDS) 或還原劑 (DTT、β-巰基乙醇) 等方法。

    ? 緩沖液存在問題。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介質純化 His 標簽蛋白時,平衡緩沖液與樣品緩沖液中的某些組分可能會干擾目的蛋白的結合。

    部分組分建議濃度如下 :

     EDTA: ≤0.1 mM (建議不要使用)

     DTT: ≤1 mM (不推薦使用)

     β-巰基乙醇: ≤20 mM (慎用)

     咪唑: ≤20 mM (因蛋白而異)


    Q:洗脫液中雜蛋白多?

    A:

    ? 洗脫條件不合適。建議使用咪唑濃度梯度或 pH 值梯度洗脫。不同蛋白質最佳洗脫條件不同,需要摸索優化。

    ? 雜蛋白與介質存在非特異性結合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入一定濃度的咪唑 (推薦濃度 : ≤20 mM,因蛋白而異),抑制非特異性結合。

    ? 雜蛋白與目的蛋白存在非特異性結合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入非離子型去垢劑 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、還原劑 (β- 巰基乙醇 : ≤20 mM) 等組分。

    ? 目的蛋白降解。建議在低溫下純化目的蛋白,并在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入蛋白酶抑制劑 (如 PMSF)。

    ? 存在表達提前終止 (C 端融合表達 His 標簽) 或二級翻譯起始 (N端融合表達 His 標簽)。建議更換表達載體。


    Q:目的蛋白沒有洗脫?

    A:

    ? 目的蛋白量太少,無法檢出。建議更換靈敏度更高的檢測方法,如用銀染法或 Western Blot 替代考馬斯亮藍染色,或優化上游表達條件,獲得更多的目的蛋白。

    ? 目的蛋白沒有結合介質。建議檢測以下全部樣品以確認蛋白:上樣前、流出、洗滌、洗脫。

    ? 目的蛋白結合牢固。建議增加洗脫強度,如采用更高濃度的咪唑或更低的 pH 值。


    原核蛋白表達常見問題解答

    Q:蛋白不表達或表達量很低?

    A:

    1、選擇正確的表達載體與表達菌株

    ? T7啟動子的載體(如pET系列載體)應選用BL21(DE3),BL21(DE3) pLysS,Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動子的表達載體 (如Tac啟動子的pGEX、pMAL系列表達載體) 應選用BL21表達菌株。

    ? 對細胞有毒性的蛋白,建議選用背景表達低、嚴謹調控誘導的菌株,如BL21(DE3) pLysS菌株。

    ? 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白,建議選用Transetta(DE3) 等菌株。

    2、嘗試不同的表達載體與菌株

       不同的蛋白,對不同載體與菌株的偏好不同,如果某一蛋白無法通過優化誘導表達條件得到明顯改善,可以更換其它菌株或表達載體。

    3、表達條件的優化

    ? 選擇不同的培養基。對于某些蛋白,在培養基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明顯提高表達量。

    ? 較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長的表達時間,一般可以加快表達的速度,促進目的蛋白的積累,從而提高表達量。但可能會降低可溶蛋白的表達量,形成包涵體。

    ? 細胞的生長狀態對蛋白表達有很大的影響,可以通過測量菌液的OD600值監測生長狀態。對于大部分蛋白,應在菌株的對數生長期(OD600=0.5) 進行誘導。


    Q:目的蛋白不可溶,形成包涵體?

    A:

    首先確認目的蛋白是否有表達。

    ? 裂解菌體并離心后,通過對全菌、上清、沉淀的檢測,確認目的蛋白是否表達,是否形成了包涵體。

    ? 包涵體的形成與蛋白自身結構、表達系統、誘導表達條件等因素有著密切關系。在無法改變蛋白自身結構的情況下,可以嘗試不同的表達載體與菌株,增強其溶解能力,優化出適合特定蛋白的表達系統。

    ? 目前認為包涵體的形成是由于蛋白在細胞內積累速度過快,沒有正確折疊而聚集沉淀??梢酝ㄟ^優化誘導表達條件,如降低誘導溫度、降低誘導物濃度、縮短表達時間、降低誘導時菌液的OD值等,以減緩蛋白的積累。


    Q:目的蛋白大小不正確?

    A:

    ? 蛋白的結構對判斷分子量大小有一定影響??梢酝ㄟ^加熱變性蛋白,從而準確判斷蛋白分子量大小。

    ? 確認蛋白表達是否完整,蛋白是否提前終止表達。

    ? 若形成二聚體甚至多聚體,可以通過加熱變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段,破壞次級結構,準確判斷分子量大小。


    RNA純化常見問題解答

    Q:提取過程中 RNA 降解

    A:

    ? 材料中的 RNA 發生降解:盡量選擇新鮮的材料,材料采集后應迅速用液氮處理。材料

    保存在液氮中或 -70℃條件下,材料均不宜長期保存,且避免反復凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整,衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴重。

    ? 操作環境的 RNase 污染:RNA 提取盡量選擇潔凈的環境,由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase,建議對提取環境進行 RNase 的清除處理。

    ? 提取用具帶來的 RNase污染:提取用所有的玻璃器皿可通過高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時)去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過 DEPC 或 NaOH 處理嚴格去除 RNase 后才可使用。

    ? 操作中帶入的 RNase 污染:人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人

    員可通過經常更換一次性手套,佩戴口罩等措施減少此類污染。


    Q:RNA 提取量低

    A:

    ? 材料 RNA 含量較低:對于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植

    物組織) 可適當提高起始材料的用量。

    ? 材料中蛋白和脂肪含量較高:蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對上清再次抽提。

    ? RNA 沉淀條件不合適:使用異丙醇沉淀 RNA 時,加入的異丙醇與提取液的比例為嚴

    格的 1:1,否則會明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過添加適量的檸檬酸鈉來改善沉淀效果。


    Q:RNA 中有基因組 DNA 污染

    A:

    ? 材料中核酸含量高:脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高,可進行多次酚 / 氯仿抽

    提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理,降解 DNA。

    ? 材料過量:增加試劑用量。

    ? RNA 沉淀條件不合適:使用異丙醇沉淀 RNA 時,加入的異丙醇與提取液的比例偏高,

    溶液的 pH 值偏小,都容易使 DNA 形成沉淀。


    Q:提取后的 RNA 樣品降解

    A:

    ? RNA 樣品反復凍融:反復凍融會使 RNA 片段斷裂,影響 RNA 的完整性。

    ? RNA 樣品保存條件不合適:根據保存時間和材料的不同,RNA 應保存在不同的溶液中。

    如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲存在甲醛或甲酰胺中以保存高質量的 RNA,而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長期穩定保存。


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